Di truyền vi khuẩn

Di truyền vi khuẩn

Di truyền là sự duy trì các đặc điểm qua nhiều thế hệ. Cơ sở vật chất của di truyền là nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể của vi khuẩn ví dụ như của E.coli gồm 5x10⁶ đôi nucleotide chia thành nhiều đoạn gọi là gen, mỗi gen quyết định sự tổng hợp một protein đặc hiệu. Những protein đặc hiệu như enzyme và những cấu tạo khác của tế bào xác định tất cả các tính trạng của một cá thể.

Nhiễm sắc thể chịu sự nhân đôi trước khi phân bào. Do đó mỗi tế bào con nhận một bộ gen tương đương với tế bào mẹ. Sự nhân đôi của nhiễm sắc thể là một quá trình chính xác, tuy nhiên mỗi gen có một xác xuất nhỏ về sai sót trong sao chép, do đó làm phát sinh đột biến. Đột biến xảy ra ngẫu nhiên không cần sự can thiệp của môi trường bên ngoài với một tần suất rất nhỏ từ 10^-5 đến 10^-9.

Sự vận chuyển di truyền ở vi sinh vật

Sự tiến hóa của vi sinh vật phụ thuộc vào sự biến dị và sự chọn lọc. Nó diễn ra chậm chạp, lúc sự biến dị xảy ra do tích lũy những biến dị liên tiếp ở một chủng sinh vật. Quá trình này trở nên nhanh chóng ở vi sinh vật nhờ các vi sinh vật phát triển  những cơ chế vận chuyển di truyền giữa các cá thể.

Vi khuẩn vận chuyển những yếu tố di truyền qua ba cơ chế: biến nạp, tải nạp và tiếp hợp.

Trong biến nạp, một đoạn ADN được vận chuyển vào tế bào nhận. Đây là một cơ chế thô sơ của sự vận chuyển gen.

Trong tải nạp và tiếp hợp, những  plasmid được vận chuyển qua trung gian của phage hoặc qua tiếp xúc.

Plasmid là những phân tử ADN dạng vòng tròn nằm ngoài nhiễm sắc thể và có khả năng tự sao chép. Plasmid có trọng khối nhỏ so với nhiễm sắc thể. Hai plasmid gọi là không phù hợp nếu chúng không thể tồn tại bền vững trong cùng một tế bào. Những plasmid F mang nhân tố sinh sản F. Những plasmid cùng tồn tại trong một vi khuẩn với nhân tố F gọi là Fi⁺ nếu chúng ngăn cản sự tiếp hợp của F, gọi là Fi^- trong trường hợp ngược lại.

Biến nạp (Transformation)

Biến nạp là sự vận chuyển ADN hòa tan của nhiễm sắc thể từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận. Khi tế bào vi khuẩn bị vỡ do làm tan (lysis), ADN dạng vòng tròn của chúng thoát ra môi trường thành các đoạn thẳng với chiều dài khác nhau, có khả năng gây biến nạp cho các tế bào nhận khác.

Griffith năm 1928 đã khám phá sự biến nạp ở phế cầu bằng thí nghiệm sau ở chuột nhắt :

Tiêm vào chuột phế cầu sống S1 có vỏ thì chuột chết vì nhiễm khuẩn huyết.

Tiêm vào chuột phế cầu R1 sống không vỏ thì chuột không chết.

Tiêm vào chuột phế cầu S1 chết thì chuột không chết.

Tiêm vào chuột hỗn hợp phế cầu S1 chết với R1 sống thì chuột chết vì nhiễm khuẩn huyết. Từ máu chuột phân lập được S1 sống có vỏ.

Griffith cũng như các nhà khoa học thời bấy giờ chưa hiểu ý nghĩa sâu xa của sự kiện.

Alloway năm 1933 thực hiện thí nghiệm ở ống nghiệm và phân lập được phế cầu S1 ở hỗn hợp phế cầu S1 chết và phế cầu R1 sống.

Avery, Mac-Leod, Mac-Carthy năm 1944 đã phân lập được nhân tố biến nạp và xác định là ADN. Nhưng lúc bấy giờ giới khoa học chưa chấp nhận ADN là chất liệu di truyền. Đến năm 1952 lúc Hershey và Chase chứng minh ADN của Phage đi vào bên trong vi khuẩn trong khi vỏ Protein bị giữ ở bên ngoài thì ADN mới được công nhận là nhân tố biến nạp.

Sự biến nạp được khám phá thêm ở nhiều vi khuẩn khác: Hemophilus, Neisseria, Streptococcus, Bacillus, Acinetobacter...

Trong biến nạp, tế bào nhận phải ở trạng thái sinh lý đặc biệt được gọi là khả nạp (competence) mới có khả năng tiếp nhận ADN hòa tan của tế bào cho. Trạng thái khả nạp xuất hiện trong một giai đoạn nhất định của quá trình phát triển của tế bào vào lúc tê bào đang tổng hợp vách.

Sau khi xâm nhập, phân tử ADN sợi kép bị một endonuclease cắt ở màng tế bào thành đoạn ngắn sợi đơn và đi vào nguyên tương . Đoạn ADN sợi đơn kết đôi với ADN của tế bào nhận ở đoạn tương đồng rồi tái tổ hợp; bằng cách đó ADN biến nạp kết hợp vào nhiễm sắc thể của tế bào nhận. Nhiễm sắc thể tái tổ hợp là phân tử ADN sợi kép của tế bào nhận trong đó một đoạn ngắn của một sợi được thay thế bằng một đoạn ADN của tế bào cho.

Đối với vi khuẩn đường ruột, sự tiếp nhận đòi hỏi sự biến đổi bề mặt của tế bào bằng cách xử lý với CaCl₂ .

Ý nghĩa của sự biến nạp:

Sự biến nạp cho phép kết hợp vào nhiễm sắc thể vi khuẩn ADN tổng hợp hoặc ADN biến đổi invitro.

Biến nạp cũng được sử dụng để xác định những vùng rất nhỏ trên bản đồ di truyền của vi khuẩn.

Biến nạp có thể xảy ra ở trong thiên nhiên. Người ta đã chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp độc lực tăng lúc tiêm 2 chủng phế cầu vào phúc mạc chuột nhắt. Như thế sự biến nạp có một ý nghĩa dịch tễ học, tuy nhiên sự vận chuyển di truyền bằng biến nạp không hữu hiệu bằng sự vận chuyển di truyền bằng plasmid.

Tải nạp (Transduction)

Tải nạp là sự vận chuyển ADN từ vi khuẩn cho đến vi khuẩn nhận nhờ phage. Trong tải nạp chung, phage có thể mang bất kỳ gen nào của vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận. Trong tải nạp đặc hiệu, một phage nhất định chỉ mang được một số gen nhất định của vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận.

Sự tải nạp chung

Kiểu tải nạp này được Zinder và Lederberg khám phá năm 1951 lúc khảo sát sự tiếp hợp ở Salmonella. Lúc lai giống chủng L₂₂ và chủng L₂, mỗi chủng mang một cặp tính trạng đột biến khác nhau thì thu được với một tỷ lệ nhỏ một số tế bào tái tổ hợp mang một cặp tính trạng đột biến như tế bào hoang dại gốc, phage P₂₂ được tìm thấy trong nước lọc canh khuẩn của 2 chủng vi khuẩn trên. Phage P₂₂ độc lực với chủng L₂ nhưng ôn hòa với chủng L₂₂. Lúc cho P₂₂ vào canh khuẩn L₂ thì tất cả tế bào của L₂ bị dung giải và phóng thích phage P₂₂ trong đó có một ít phage chứa một mảnh ADN của L₂. Lúc cho chủng L₂₂ vào dung dịch phage P₂₂ nói trên thì một số phage vận chuyển những gen của L₂ vào L₂₂ và vi khuẩn tự dưỡng như type hoang dại được phát sinh qua tái tổ hợp.

Sự  tải nạp đặc hiệu

Năm 1954 Mores nhận thấy phage ôn hòa có thể thực hiện một kiểu tải nạp khác gọi là tải nạp đặc hiệu. Nó chỉ vận chuyển một nhóm giới hạn gen, nhóm gen được chuyển nằm sát chổ prophage gắn vào ở nhiễm sắc thể. Sự tải nạp đặc hiệu vận chuyển những gen đặc hiệu ở nhiễm sắc thể và đòi hỏi sự tích hợp của phage. Hơn nữa khác với tải nạp chung, phage tải nạp đặc hiệu chỉ được phóng thích lúc chiếu tia cực tím chứ không bao giờ tự tách rời khỏi nhiễm sắc thể.

Lúc chiếu tia cực tím vào một canh khuẩn E.coli K₁₂ Gal+ sinh tan với phage l thì trong những phage được phóng thích có khoảng 10^-6l d Gal. l dGal là phage l mang gen Gal nhưng thiếu một dọan ADN mà nó để lại trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Đó là phage không hoàn chỉnh không thể nhân lên nếu không bổ sung đoạn ADN bị thiếu nhưng có thể vận chuyển gen Gal. Lúc cho dịch dung giải nói trên vào canh khuẩn E.coli K₁₂ Gal- thì thu được khỏang 10^-6 vi khuẩn tải nạp galactose dương tính. Đó là hiện tượng tải nạp tần số thấp LFT (Low Frequency Transduction). Một số ít tế bào trong canh khuẩn E.coli K₁₂ Gal-  nhiễm dịch LFT trở nên hai lần sinh tan với phage l bình thường và phage l dGal. Những tế bào này hình thành clon tế bào hai lần sinh tan. Lúc chiếu tia cực tím vào những tế bào nói trên thì thu được một dịch phage trong đó những phage l và phage l dGal bằng nhau. Đó là sự tải nạp tần số cao (High  Frequency Transduction).

Ý nghĩa của sự tải nạp:

Sự tải nạp có thể cho phép xác định những gen rất gần nhau ở nhiễm sắc thể, do đó được sử dụng để thiết lập bản đồ di truyền. Dựa vào tần số tải nạp hai gen cùng một lúc người ta có thể xác định khoảng cách giữa các gen và nhờ thế xác định vị trí của chúng.

Trong thiên nhiên sự tải nạp giữ một vai trò có ý nghĩa trong lây lan các plasmid kháng thuốc ở vi khuẩn gram dương như plasmid penicillinase ở tụ cầu. Ngoài ra prophage có thể đem lại cho vi khuẩn một số tính chất đặc biệt quan trọng ví dụ prophage b ở trực khuẩn bạch hầu.

Tiếp hợp (Conjugation)

Tiếp hợp là hiện tượng vận chuyển những yếu tố di truyền từ vi khuẩn cho (đực) sang vi khuẩn nhận (cái) khi hai vi khuẩn tiếp xúc với nhau.

Lederberg và Tatum lần đầu tiên năm 1946 phát hiện ra sự tiếp hợp ở vi khuẩn. Hỗn hợp hai biến chủng E.coli K₁₂ với nhau. Chủng 1 khuyết dưỡng với Biotin và Methionin nhưng có khả năng tổng hợp Threonin và Leucin ký hiệu B^-M^-T⁺ L⁺. Chủng 2 khuyết dưỡng với Threonin và Leucin nhưng tổng hợp được Biotin và Methionin, ký hiệu  B⁺M⁺T^- L^-.

Cả hai biến chủng này không mọc được trong môi trường tổng hợp tối thiểu  không chứa bốn chất trên nên không tạo thành khuẩn lạc.

Nếu trộn hai biến chủng trên với nhau rồi cấy vào môi trường tối thiểu thì thấy mọc các khuẩn lạc với tần số 10^-6 . Điều này cho thấy hai chủng lọai vi khuấn qua trao đổi gen đã tạo thành các tế bào tái tổ hợp có khả năng tổng hợp bốn chất: Biotin, Methionin, Threonin, Leucin, ký hiệu B⁺, M⁺, T⁺, L⁺.

Hiện tượng tiếp hợp liên quan đến nhân tố sinh sản F. Nhân tố F là một plasmid. Tế bào chứa F là tế bào đực hay tế bào F⁺ đóng vai trò tế bào cho. Tế bào không chứa F hay là tế bào cái F^- dóng vai trò tế bào nhận. Trong thí nghiệm tiếp hợp trên, chủng (1) đóng vai trò chủng cho và chủng (2) đóng vai trò chủng nhận.

Từ các tế bào F⁺, Cavalli đã phân lập được các tế bào Hfr (High frequency of recombination) có khả năng vận chuyển gen với một tần số cao. Khi lai Hfr x F^- thì thu được các tế bào tái tổ hợp 1000 lần nhiều hơn khi lai F⁺x F^-.

Trong các tế bào F⁺ nhân tố F tạo nên một lực đặc biệt gọi là lực tiếp hợp. Chính nhờ lực này mà xảy ra sự tiếp hợp giữa các vi khuẩn.

Trong các tế bào Hfr nhân tố F tích hợp vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn và chỉ có khả năng sao chép cùng với nhiễm sắc thể. Ở tế bào Hfr nhân tố F cũng tạo nên một lực tiếp hợp, nhưng trong quá trình tiếp hợp vì nằm cuối bộ gen, nó đẩy bộ gen vào tế bào nhận qua cầu nguyên tương nối liền hai tế bào tiếp hợp.

Ở tế bào Hfr trong một số trường hợp F có thể tách rời khỏi nhiễm sắc thể và mang theo một đoạn ADN của nhiễm sắc thể và được gọi là F’. F’ có khả năng tự sao chép và có thể vận chuyển vào tế bào nhận. F’ có thể vận chuyển một số tính trạng của một vi khuẩn này sang một vi khuẩn khác. F’ được sử dụng để phân lập và vận chuyển một số gen chọn lọc.

Tiếp hợp thường xảy ra giữa những vi khuẩn cùng loài nhưng cũng có thể xảy ra giữa những vi khuẩn khác loài như E.coli với Salmonella hoặc Shigella nhưng tần số tái tổ hợp thấp.

Ý nghĩa của sự tiếp hợp:

Sự tiếp hợp là một công cụ khảo sát quan trọng trong nhiều lĩnh vực sinh lý và di truyền vi khuẩn vì nó cho phép tạo nên những vi khuẩn phối hợp nhiều đột biến khác nhau.

Nhờ kỹ thuật tiếp hợp ngắt quãng người ta thiết lập bản đồ nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Ngoài ra chủng F’ được sử dụng để nghiên cứu hoạt động của một số gen.

Trong thiên nhiên sự tiếp hợp giữ một vai trò đáng kể trong biến dị của vi khuẩn đặc biệt trong lây lan tính kháng thuốc  giữa các vi khuẩn Gram âm.

DI TRUYỀN VỀ TÍNH KHÁNG THUỐC

Các vi khuẩn kháng thuốc được tìm thấy khắp nơi kể cả những nơi chưa bao giờ sử dụng kháng sinh. Ngay khi phát minh penicilin năm 1940, vi khuẩn kháng penicilin đã được báo cáo. Ngày nay vấn đề kháng thuốc trở thành mối bận tâm hàng đầu trong điều trị các bệnh nhiễm trùng và kháng sinh đồ là một thử nghiệm hàng ngày ở các phòng xét nghiệm vi trùng.

Sự hình thành tính kháng thuốc ở vi sinh vật là do sự biến đổi gen ở nhiễm sắc thể hoặc do tiếp nhận plasmid kháng thuốc.

Vi khuẩn trở nên kháng thuốc qua 4 cơ chế: đột biến, tái tổ hợp hoặc thu hoạch plasmid kháng thuốc hoặc thu hoạch transposon .

Đột biến thành kháng thuốc

Nhiều thí nghiệm đã chứng minh tính kháng thuốc phát sinh do đột biến, như thế tính kháng thuốc liên hệ đến sự biến đổi gen ở nhiễm sắc thể và có thể di truyền cho các thế hệ sau. Sự đột biến xảy ra với tần suất 10^-5 - 10 ^-9 .

Trong tính kháng thuốc, kháng sinh giữ vai trò chọn lọc chứ không phải vai trò chỉ đạo. Việc sử dụng rộng rãi kháng sinh làm phát triển nhanh chóng các vi khuẩn kháng thuốc bằng cách giết chết các vi khuẩn nhạy cảm, tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc phát sinh do đột biến chiếm ưu thế.

Sự tái tổ hợp

Lúc một đột biến kháng thuốc xuất hiện ở một quần thể vi khuẩn thì vi khuẩn kháng thuốc có thể vận chuyển gen kháng thuốc đến các vi khuẩn nhạy cảm theo một trong 3 cơ chế vận chuyển di truyền: biến nạp, tải nạp và tiếp hợp tùy theo loài vi khuẩn. Sự tái tổ hợp giữa 2 vi khuẩn, mỗi vi khuẩn kháng một kháng sinh làm xuất hiện những vi khuẩn kháng với cả 2 loại kháng sinh.  Trong thiên nhiên, sự vận chuyển gen kháng thuốc trong tải nạp và tiếp hợp xảy ra với một tần suất thấp khoảng  10^-5.  Trong biến nạp tần suất chưa được biết, nhưng có thể còn thấp hơn nữa.

Thu hoạch plasmid kháng thuốc 

Hai cơ chế kháng thuốc trên liên quan đến gen kháng thuốc nằm ở trên nhiễm sắc thể. Ở đây tính kháng thuốc liên hệ đến plasmid nằm ngoài nhiễm sắc thể. Plasmid kháng thuốc được vận chuyển theo những cơ chế khác nhau tùy theo vi khuẩn  Gram dương hoặc vi khuẩn Gram âm.

Plasmid kháng thuốc ở vi khuẩn Gram âm

Năm 1946 lần đầu tiên ở Nhật Bản người ta phân lập nhiều chủng Shigella kháng với nhiều kháng sinh : streptomycin, chloramphenicol, tetracyclin, sulfonamit. Nhân tố chịu trách nhiệm về tính kháng nhiều thuốc là một plasmid kháng thuốc goi là nhân tố R. Nhân tố R điển hình là một plasmid lớn với 2 phần, chức năng riêng biệt. Phần thứ nhất RTF gọi là nhân tố vận chuyển đề kháng (Resistance transfer factor), khoảng 80 kb chứa những gen của sự tự sao chép và của sự tiếp hợp. Phần kia nhỏ hơn là quyết định đề kháng (R determinant), kích thước rất thay đổi và chứa gen kháng thuốc (R genes) RTF và quyết định đề kháng thông thường tạo nên một đơn vị. Nhân tố R thường tái tổ hợp với nhau làm phát sinh những tổ hợp mới về kháng thuốc.

Nhân tố R không những có thể lây truyền rộng rãi trong nhiều loài vi khuẩn đường ruột mà còn có thể lây truyền cho nhiều vi khuẩn khác như vi khuẩn tả, vi khuẩn dịch hạch...

Nhân tố R lây truyền trong vi khuẩn qua tiếp xúc nên tính kháng thuốc lan tràn trong một quần thể vi khuẩn nhạy cảm như một bệnh truyền nhiễm .

Plasmid kháng thuốc ở vi khuẩn Gram dương

Sự đề kháng của nhiều chủng tụ cầu vàng với penicillin, erythromycin và nhiều kháng sinh cũng do plasmid gây nên. Plasmid ở vi khuẩn Gram dương không thể vận chuyển bằng tiếp hợp mà bằng tải nạp qua trung gian của phage. Hiện nay phần lớn những chủng tụ cầu kháng penicillin ở bệnh viện đều mang plasmid penicillinase.

Thu hoạch transposon

Transposon còn gọi là gen nhảy là những đoạn ADN, kích thước nhỏ chứa một hay nhiều gen có 2 đầu tận cùng là những chuổi nucleotic giống nhau nhưng ngược chiều nhau (inverted repeat). có thể nhảy từ plasmid vào nhiễm sắc thể hoặc từ nhiễm sắc thể vào plasmid hoặc từ plasmid đến plasmid. Tất cả  mọi gen trong đó có gen kháng thuốc có thể nằm trên transposon. Những transposon chỉ đạo sự kháng kim loại nặng, sự tạo thành độc tố và khả năng sử dụng một số chất chuyển hóa (lactose, raffinose, histidin, hợp chất lưu huỳnh) đã được mô tả. Đặc biệt quan trọng trong vi sinh học là những transposon kháng kháng sinh như Tn3 mang gen kháng ampicillin, Tn5 mang gen kháng kanamycin, Tn10 mang gen kháng tetracyclin, Tn4 mang gen kháng ba kháng sinh ampicillin, streptomycin và sulfamit.