PARVO VIRUS B19 REAL- TIME PCR

PARVO VIRUS B19 REAL- TIME PCR

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích

Phát hiện và định lượng Parvo virus B19 trong huyết tương hoặc huyết thanh và dịch ối của người.

Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR. 

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

Máy tách chiết acid nucleic.

Bộ lưu điện.

Máy ủ nhiệt.

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

Máy ly tâm lạnh > 12000 gpm/phút

Tủ lạnh 2⁰C -8⁰C

Tủ âm sâu (-20⁰ C) hoặc (-70⁰C) (nếu có)

Máy vortex

Tủ an toàn sinh học 

Micropipettes các thể tích từ 0,5 µl - 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

	STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị
	1		Khay đựng bệnh phẩm		Cái
	2		Hộp vận chuyển bệnh phẩm		Cái
	3		Tube đựng bệnh phẩm 5 ml		Cái
	4		Cryotube (lưu mẫu dương tính)		Cái
	5		LightMix® Kit Parvovirus B19		Test
6		LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe		Test
7		LightCycler 8-Tube Strips		Cái
8		Hóa chất và VTTH cho tách chiết trên MPLC		Test
9		LightMix Color Compensation 530 / 690		Test
10		Hóa chất chạy đường chuẩn		Test
11		Pipet nhựa		Cái
12		Đầu Pipét có lọc 1000 ul		Cái
13		Giấy thấm không bụi		Cuộn
14		Giấy xét nghiệm		Tờ
15		Sổ lưu kết quả xét nghiệm		Quyển
21		Bút viết kính		Cái
22		Bút bi		Cái
23		Mũ giấy		Cái
24		Khẩu trang		Cái
25		Găng không có bột tal		Đôi
26		Găng tay xử lý dụng cụ		Đôi
27		Quần áo		Bộ
28		Dung dịch xà phòng rửa tay		ml
29		Cồn sát trùng tay nhanh		ml
30		Dung dịch khử trùng		ml
31		Khăn lau tay		Cái
32		Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Huyết thanh, huyết tương, và dịch ối.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

Tiến hành kỹ thuật

LightMix® Kit Parvovirus B19 EC (Roche – VD hoặc tương đương)

Thu nhận và xử lí mẫu

Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết RNA nếu cần.

Tách chiết DNA: 

Tách chiết bằng tay hoặc máy tự động 

Chạy bù màu và thẩm định file bù màu:

Theo hướng dẫn kit LightMix^®Color Compensation HybProbe. Bù màu khuyến cáo chạy khi thay lô của kít ho c 6 tháng chạy bù màu 1 lần.

Thực hiện phản ứng real-time PCR

Bật máy LC480, bật máy tính và phần mềm LC480.

Pha hóa chất: 

Pha hỗn hợp primer và probe cho B19 (PSR) và Chứng nội ECT (reaction control)

Chuẩn bị ECT

Chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị NTC (chứng âm)

Chuẩn bị dãy ống mẫu chuẩn

Chuẩn bị trộn hỗn hợp phản ứng PCR 

Chạy real-time PCR

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Điều kiện của phản ứng

Giá trị định lượng chấp nhận được nếu cả 3 chứng: chứng âm, chứng dương và chứng nội có nghĩa. Các chứng có giá như sau:

Chứng âm: không phát hiện.       

Chứng dương: nằm trong khoảng cho phép của nhà sản xuất (đặc hiệu với từng lô thuốc thử). 

Chứng nội: với chứng âm và mẫu có nồng độ thấp (10-1000 copies) phải có tín hiệu lên ứng với Ct khoảng 27 đến 30.

Ngược lại:

Chứng âm: Nếu chứng âm không hợp lệ thì phải thực hiện lại xét nghiệm cả chứng và toàn bộ lô bệnh phẩm.

Chứng dương: Nếu chứng dương không hợp lệ thì phải làm lại xét nghiệm toàn bộ mẻ chạy.

Chứng nội: không có tín hiệu lên với chứng âm và mẫu có nồng độ thấp (10-1000copies) ứng với Ct khoảng 27 đến 30 thì phải chạy lại mẫu đó.

Phân tích mẫu

Bảng biện luận kết quả:

Mẫu Parvo B19 Kênh 640	Chứng nội Kênh 670	Chứng dương Kênh 640	Chứng âm NTC Kênh 640	Biện luận kết quả
Không khuếch  đại	Có khuếch đại	Khuếch đại	Âm tính	Âm tính (không phát hiện)
Ct < 37	NA	Khuếch đại	Âm tính	Dương tính cho B19
Không khuếch đại	Không khuếch đại	Khuếch đại	NA	PCR Failed, chạy lại
NA	NA	Không khuếch đại	NA	PCR Failed, chạy lại
NA	NA	NA	Dương tính	Nhiễm, Chạy lại

Hệ số chuyển đổi

Định lượng virus (VL) được tính toán sử dụng công thức sau:

VL(copies/ml) = MV(giá trị đo được) x EVF x SF

Trong đó:

VL = giá trị định lượng

MV = giá trị đo được [số copy trên phản ứng]

EVF = hệ số thể tích tách chiết [thể tích tách chiết thu được/ thể tích PCR] SF = hệ số mẫu [1000 µl/thể tích tách chiết của mẫu bệnh phẩm] Ví dụ: 

Lấy 200 µl mẫu bệnh phẩm đi tách chiết thì hệ số mẫu SF = 1000/200=5.  Dùng 5 µl trong tổng thể tích thu hồi là 100 µl làm template mix PCR thì hệ số thể tích tách chiết = 100/5=20.

Kết quả hệ số chuyển đổi là:

VL (copies/ml) = MV (giá trị đo được copies/phản ứng 20 µl) x 5 x 20

VL (copies/ml) = MV(copies/phản ứng) x 100

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Sự cố:

Có mẫu và chứng nội cũng đềuu âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

Nguyên nhân:

Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế. 

Khắc phục:

Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu.

Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.