MTB (MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS) KHÁNG KHÁNG SINH NỒNG ĐỘ CAO MÔI TRƯỜNG LỎNG

 

MTB (MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS) KHÁNG KHÁNG SINH NỒNG ĐỘ CAO MÔI TRƯỜNG LỎNG

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích      

Xác định tính nhạy cảm và đề kháng với kháng sinh Isoniazid nồng độ 33,2 µg/ml của vi khuẩn lao

Nguyên lý

Môi trường MGIT cung cấp dinh dưỡng cho sự phát triển của Mycobacteria. Hợp chất huỳnh quang gắn dưới đáy tuýp nhạy cảm với oxy hòa tan trong môi trường, khi có vi khuẩn mọc tiêu thụ oxy, hợp chất sẽ phát quang. 

Cho thêm kháng sinh vào môi trường để phát hiện tính kháng thuốc của vi khuẩn. Chủng vi khuẩn lao pha theo tỉ lệ qui định, cấy vào môi trường lỏng MGIT có và không có thuốc chống lao, nhập vào máy BACTEC MGIT.

Hệ thống máy giám sát liên tục sự phát quang của tuýp cấy dựa vào đơn vị sinh trưởng (GU). Kết quả KSĐ được máy tự động phân tích và báo tín hiệu hiển thị trên màn hình, dựa trên so sánh sự phát triển của M. tuberculosis trong tuýp chứng và các tuýp có thuốc khi tuýp chứng đạt GU 400, ngưỡng kháng thuốc GU 100

Tuýp có thuốc GU dưới 100 là nhạy cảm. Tuýp có thuốc GU > = 100 là kháng thuốc

CHUẨN BỊ

Người thực hiện:

Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học ho c sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị          

Tủ ATSH loại 2A     

Máy vortex

Nồi hấp tiệt trùng

Tủ lạnh

Đồng hồ phút

Máy BACTEC MGIT 

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT	Chi phí hóa chất và vật tư tiêu hao	Đơn vị tính
1	MGIT tuýp loại 7 ml	tuýp
2	MGIT supplement	ml
3	INH KIT	ml
4	Cồn 700	ml
5	Nước cất	ml
6	Presept 2,5	viên
7	Microshiel	ml
8	MacFaland 1	ống
9	MacFaland 0.5	ống
10	Dung dịch rửa dụng cụ thủy tinh	ml
11	H2SO4	ml
12	Potassium Kali dicromate	gam
13	Pipette Paster nhựa vô trùng	cái
14	Đầu côn nhựa loại  1ml có lọc	cái
15	Đầu côn nhựa loại 0,1 ml có lọc	cái
16	Tuýp lưu chủng	cái
17	Hộp lưu chủng	cái
18	Túi nilon loại 2 lit chịu nhiệt hấp	cái
19	Túi rác vàng hủy vật liệu lây nhiễm	cái
20	Khẩu trang N95	cái
21	Găng tay cao su	đôi
22	Dung dịch tẩy rửa dụng cụ	ml
23	Thùng rác có nắp	cái
24	Thùng vận chuyển vật liệu lây nhiễm	cái
25	Khay đựng bệnh phẩm	cái
26	Chổi rửa tuýp, dụng cụ	cái
27	Chai th y tinh trung tính 1000ml	cái
28	Quần áo bảo hộ	cái
29	Quần áo công tác	bộ
30	Khăn lau tay	cái
31	Găng sạch (tiêm)	đôi
32	Bút chì đen HB	Cái
33	Bút dạ	Cái
34	Bút bi	cái
35	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	trang
36	Giấy trả kết quả xét nghiệm	Tờ
37	Nội kiểm
38	Ngoại kiểm

Chú ý: - Chi phí nội kiểm được tính bằng 1/10 tổng chi phí hóa chất, dụng cụ, VTTH. Chi phí ngoại kiểm được tính từ PXN chuẩn quốc tế 35,000đ/XN.

Bệnh phẩm

Ch ng M.tuberculosis thuần từ ống MGIT dương tính dưới 5 ngày tuổi hoặc chủng dương tính trên môi trường đặc dưới 14 ngày tuổi.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Chuẩn bị

Chuẩn bị chủng làm KSĐ

Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn

Chuẩn bị thuốc chống lao

Chuẩn bị thuốc chống lao từ bộ kit theo bảng sau

Tên thuốc	Nồng độ đông khô μg	Thể tích  dung môi  ml	Nồng độ sau pha μg/ml	Thể tích   thêm vào tuýp MGIT µl	Nồng độ trong tuýp MGIT µg/ml
INH nồng độ cao
INH	66.4	2	33.2	100	0.4

Lưu ý:

Nếu thuốc bảo quản lạnh, để nhiệt độ phòng 15 phút trước khi pha 

Thuốc đã pha chia lượng nhỏ bảo quản lạnh -20⁰ C hoặc lạnh hơn trong 6  tháng, nhưng không quá hạn ghi trên nhãn thuốc.

Thực hiện kỹ thuật

Chỉ định INH nồng độ cao, dán nhãn 2 tuýp MGIT 7 ml theo thứ tự:  GC,  INH và tuýp PNB (nếu cần)   

Thêm 0,8 ml BACTEC MGIT 960 SIRE Supplement cho mỗi tuýp.

Thêm 100µl dung dịch thuốc vào các tuýp theo nhãn thuốc tương ứng, không cho thuốc vào tuýp GC. 

Thêm 166 µl dung dịch PNB (nồng độ 25 mg/ml ) vào tuýp dán nhãn PNB (nếu cần)

Cấy 0,5 ml huyền dịch vi khuẩn tỉ lệ 1:100 vào tuýp GC. 

Cấy 0,5ml huyền dịch vi khuẩn tỉ lệ 1:5 hoặc tương đương vào mỗi tuýp có thuốc và tuýp PNB. Vặn chặt nắp và đảo ngược tuýp 3-4 lần. 

Nhập giá AST vào máy BACTEC MGIT 

Tuýp PNB nhập máy riêng  như 1 ống cấy thông thường. 

Nhận định kết quả

Máy tự động đọc kết quả. Khi có tín hiệu máy báo, lấy bộ AST ra khỏi máy, quét mã vạch, in kết quả KSĐ

Kết quả KSĐ: Nhạy (S); kháng (R), và lỗi (X).

Kết quả nhạy khi tuýp có thuốc GU dưới 100

Kết quả kháng khi tuýp có thuốc GU > = 100

Lỗi (X): E 400 và E 200 có thể do pha huyền dịch vi khuẩn đặc hoặc vi khuẩn tạo cụm, chủng ngoại nhiễm, chủng mix mycobacteria hoặc chủng kháng thuốc mọc chậm hoặc huyền dịch vi khuẩn loãng.

Sai sót và xử trí

Sai sót

Do chủng nhiễm, vi khuẩn tạo thành cụm trong huyền dịch, pha huyền dịch đặc;  do pha huy n dịch loãng hoặc chủng kháng thuốc mọc chậm.

Ống PNB dương tính chủng làm KSĐ không phải MTB hoặc chủng lẫn

Chất lượng kháng sinh: pha không chuẩn, bảo quản sai…

Nhiễm chéo trong quá trình thao tác kỹ thuật.

Thực hành không an toàn.

Xử lý

Chủng pha đặc hoặc loãng cần làm lại KSĐ

Chủng nhiễm cần xử lí cấy lại thuần chủng

Chủng lẫn cần phân lập hoặc chuyển phương pháp

Chủng NTM không làm KSĐ với thuốc lao.