DENGUE VIRUS REAL-TIME RT-PCR

DENGUE VIRUS REAL-TIME RT-PCR

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích

Phát hiện RNA đặc trưng của virus Dengue trong huyết thanh hoặc huyết tương  người. 

Nguyên lý

Xác định sự có mặt của gen đặc trưng sử dụng các cặp mồi và probe cho virus Dengue bằng kỹ thuật Real-time RT- PCR

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Tủ thao tác PCR

Máy Real-time PCR và hệ thống máy vi tính

Bộ lưu điện

Máy ly tâm > 12000 gpm/phút

Máy ly tâm lạnh dùng cho tube 0,2 ml

Máy ủ nhiệt  

Máy vortex

Tủ lạnh 2⁰C - 8⁰C

Tủ âm sâu (-20⁰C hoặc -70⁰C)     

Micropipette 10 – 1000 μl.

Hóa chất, sinh phẩm và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

** Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

Tiến hành kỹ thuật

Tách chiết RNA tổng số 

Thực hiện Real-time RT-PCR

Thực hiện bước này với các tube qPCR mix được giữ trong khay giữ lạnh hoặc trên đá vảy.

Chỉ lấy đủ số tube qPCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng qPCR  phải spin down nhanh tube qPCR để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube

Chuẩn bị các thành phần của phản ứng Real-time RT-PCR

Thêm 5 µl của mẫu RNA, chứng dương hoặc chứng âm vào từng tube qPCR đã gồm đầy đủ các thành phần.

Khởi động  máy  real-time  PCR. Khởi động máy tính và chương trình realtime PCR

Cài đặt vị trí mẫu trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy realtime PCR 

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động. 

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Đọc kết quả ở bước sóng 530 (kênh màu FAM)

NHỮNG LƯU Ý VÀ XỬ TRÍ

Đọc kỹ hướng dẫn qui trình xét nghiệm trước khi thực hiện. 

Bảo quản bộ kit theo đúng hướng dẫn theo hướng dẫn của nhà sản xuất, riêng thành phần mẫu chứng dương nên giữ ở -80^o C cho bảo quản lâu dài.

Khu vực tách RNA, mix phản ứng qPCR phải được bố trí biệt lập và khử trùng bề mặt bằng dung dịch sodium hypochloride 0,5%, dụng cụ sau sử dụng phải rửa kỹ dưới vòi nước với xà phòng, sau đó lau lại bằng dung dịch RNase AWAY™ Decontamination Reagent; chiếu tia tử ngoại khi trước và sau khi thao tác để tránh nhiễm chéo.

Quá trình mix thực hiện trên đá vẩy hoặc PCR cooler, thực hiện chạy Realtime-PCR ngay sau khi mix xong phản ứng.

Trong trường hợp mẫu chứng dương và mẫu chứng âm xuất hiện không đúng với diễn giải ở phần IV thì phải kiểm tra lại Master mix, chứng dương và quá trình tách RNA tổng số, thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.