CORONAVIRUS REAL –TIME PCR

CORONAVIRUS REAL –TIME PCR

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích

Xác định sự có mặt của RNA đặc trưng của Coronavirus trong mẫu bệnh phẩm của người.

Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR. 

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học)..

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học tối thiểu cấp 2

Máy ủ nhiệt

Máy ly tâm dùng cho ống bệnh phẩm 5ml 

Máy ly tâm > 12000 gpm/phút dùng cho tube 0,2 ml

Máy vortex

Máy chạy PCR

Máy chạy Real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

Các loại Micropipette điều chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl

Tủ lạnh thường

Tủ âm sâu (-20⁰C) hoặc (-70⁰C) (nếu có)

Bộ lưu điện

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

	STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị
	1		Tăm bông vô trùng		Kg
	2		Tube đựng bệnh phẩm vô trùng		Tube
	3		Găng không có bột tan ( DNase-RNase free)		Cái
	4		Khay đựng bệnh phẩm		Cái
	5		Hộp vận chuyển bệnh phẩm		Cái
	6		Sinh phẩm chẩn đoán		Test
	7		Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng		Test
	8		Bộ kít chiết tách RNA tổng số		Hộp
	9		Bộ kít tổng hợp cDNA
			(Nếu bộ kít chạy Real-time PCR không bao gồm RT- PCR)		Hộp
	10		Ngoại kiểm (nếu có)*
	11		ống Falcon 50ml		Cái
	12		Ependoff 1,7ml		Tube
	13		Ependoff 0,2ml		Tube
	14		Đầu côn 10 µl có lọc		Cái
	15		Đầu côn 30 µl		Cái
	21		Đầu côn 200 µl có lọc		Cái
	22		Đầu côn 1 ml có lọc		Cái
	23		Water-DEPC Treated		ml
	24		Giấy thấm		Cuộn
	25		Giấy xét nghiệm		Tờ
	26		Sổ lưu kết quả xét nghiệm		Tờ
	27		Bút viết kính		Cái
	28		Bút bi		Cái
	29		Mũ		Cái
	30		Khẩu trang		Cái
	31		Găng tay xử lý dụng cụ		Đôi
	32		Quần áo bảo hộ		Bộ
	33		Dung dịch xà phòng rửa tay		ml
	34		Cồn sát trùng tay nhanh		ml
	35		Dung dịch khử trùng		ml
	36		Khăn lau tay		Cái
37		Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Chủ yếu là chất tiết đường hô hấp: Ngoáy họng, ngoáy mũi, dịch phế quản, dịch tỵ hầu, đờm. Ngoài ra còn có trong phân, máu, các loại dịch cơ thể nghi ngờ nhiễm coronavirus

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

Tiến hành kỹ thuật

Thu nhận và xử lý mẫu: 

Với các loại dịch nhớt, nhầy, phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết RNA

Với tăm bông ngoáy họng, ngoáy mũi, cho bệnh phẩm ở đầu tăm bông vào một tube vô trùng có chứa sẵn 0,5 ml nước Water-DEPC Treated, ngoáy vào thành ống tube ít nhất 05 lần cho bệnh phẩm hòa tan vào dung dịch. Sử dụng dung dịch này để tách chiết RNA.

Bệnh phẩm đã được thuần nhất có thể lưu giữ ở -20^oC trong 03 tháng nếu chưa được tách chiết.

Tách chiết RNA 

Chạy phản ứng RT-PCR dùng mồi ngẫu nhiên (Bỏ qua bước này nếu kít sử dụng real-time PCR có chứa luôn phản ứng RT-PCR)

Bật máy PCR 15 phút trước khi chạy phản ứng RT-PCR

Thực hiện bước này với các tube RT-PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube RT-PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng RTPCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

Cho dịch RNA tách chiết vào từng tube RT-PCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy PCR.

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy PCR hoạt động theo hướng dẫn của bộ kit RT-PCR. 

Cho máy PCR chạy chương trình.

Chạy phản ứng Real-time PCR

Bật máy real-time PCR 15 phút trước khi cho máy chạy. Bật máy tính và khởi động chương trình real-time PCR. 

Thực hiện bước mix với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube Real-time PCR Mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

Cho chứng +, chứng -, các nồng độ standard, dịch cDNA vừa thu nhận được (hoặc RNA vừa tách được nếu kít Real-time PCR có chứa phản ứng RTPCR) vào từng tube Real-time PCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.

Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

Chọn màu cho mẫu, chứng dương, chứng âm, standart theo hướng dẫn của bộ kít sử dụng

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động

Lưu file dữ liệu vào máy tính

Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Nhận định kết quả qua phân tích của máy dựa trên cơ sở hướng dẫn của bộ kít Real-time PCR được sử dụng.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Sự cố:

Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

Nguyên nhân:

Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế. 

Khắc phục:

Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu.

Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.