CHIKUNGUNIA IgM

CHIKUNGUNIA IgM

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích

Phát hiện kháng thể IgM kháng Chikungunya trong huyết thanh hoặc huyết tương người

Nguyên lý

Phát hiện kháng thể IgM kháng Chikungunya bằng kỹ thuật ELISA (miễn dịch gắn enzym) 

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Hệ thống máy ELISA 

Pipet tự động hay bán tự động điều chỉnh được dùng phân phối các thể tích từ 2 µl đến 200 µl .

 Máy ly tâm

Tủ lạnh 4⁰C – 8⁰C

Tủ âm sâu (-20⁰C) hoặc (-70⁰C) (nếu có)

            Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị
1		Bông		Kg
2		Dây garô		Cái
3		Cồn		ml
4		Bơm kim tiêm		Cái
5		Panh		Cái
6		Khay đựng bệnh phẩm		Cái
7		Hộp vận chuyển bệnh phẩm		Cái
8		Tube đựng bệnh phẩm		Cái
9		Sinh phẩm chẩn đoán		Test
	10		Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng		Test
	11		Nước cất		ml
	12		Đầu côn 1000 µl		Cái
	13		Đầu côn 200 µl		Cái
	14		Giấy thấm		Cuộn
	15		Giấy xét nghiệm		Tờ
	16		Sổ lưu kết quả xét nghiệm		Tờ
	17		Bút viết kính		Cái
	18		Bút bi		Cái
	19		Mũ		Cái
	20		Khẩu trang		Cái
	20		Găng tay		Đôi
	21		Găng tay xử lý dụng cụ		Đôi
	22		Quần áo bảo hộ		Bộ
	23		Dung dịch xà phòng rửa tay		ml
	24		Cồn sát trùng tay nhanh		ml
	25		Dung dịch khử trùng		ml
	26		Khăn lau tay		Cái
	27		EQAS (nếu thực hiện)*

Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Huyết thanh hoặc huyết tương. 

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất ví dụ sử dụng sinh phẩm Chikungunya IgM ELISA Kit

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

Tiến hành kỹ thuật

Bộ sinh phẩm Chikungunya IgM ELISA Kit (VD hoặc tương đương)

Qui trình chạy mẫu Chikungunya IgM ELISA Kit:

Các bước	Nội dung
3.1	Chuẩn bị đủ số giếng cần sử dụng.
3.2	Pha dung dịch rửa: Pha dung dịch rửa bằng nước cất với tỷ lệ 1 dung dịch rửa + 19 nước cất.
3.3	Lọ kháng nguyên Chikungunya đông khô được hoàn nguyên bằng 1ml dung dịch nước rửa.
3.4	Cho 50 µl chứng thấp, chứng chuẩn, chứng cao hoặc bệnh phẩm vào các giếng tương ứng.( Giếng A1 là giếng trống). Đậy tấm.
3.5	Ủ ở 37 oC ± 1oC trong 60 ± 5 phút
3.6	Cho 50µl dung dịch kháng nguyên đã hoàn nguyên vào các giếng (trừ giếng trống). Đậy tấm.
3.7	Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng
3.8	Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa. Ngâm >5 giây giữa mỗi lần rửa. Thấm khô.
3.9	Cho 50 µl dung dịch kháng thể vào các giếng (trừ giếng trống). Đậy tấm.
3.10	Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng
3.11	Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa. Ngâm >5 giây giữa mỗi lần rửa. Thấm khô.
3.12	Cho 50 µl dung dịch cộng hợp Streptavidin peroxidase vào các giếng (trừ giếng trống). Đậy tấm.
3.13	Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng
3.14	Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa. Ngâm >5 giây giữa mỗi lần rửa. Thấm khô.
3.15	Cho vào mỗi giếng 100 µl TMB.
3.16	Để ở nhiệt độ phòng đúng 15 phút, tránh ánh sáng.
3.17	Cho 100 l dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng.
3.18	Đọc kết quả trên máy đọc ELISA ở bước sóng 450/620 nm trong vòng 30 sau khi nhỏ dung dịch dừng phản ứng
3.19	Để ở nhiệt độ phòng đúng 15 phút, tránh ánh sáng.
3.20	Cho 100 µl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng.
3.21	Đọc kết quả trên máy đọc ELISA   bước sóng 450/620 nm trong vòng 30 sau khi nhỏ dung dịch dừng phản ứng

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Tính giá trị ngưỡng:

Kết quả được đọc trên máy đọc ELISA như sau:

Thử nghiệm có giá trị khi thỏa mãn điều kiện:

Giếng trống < 0.1

Chứng thấp < chứng chuẩn < chứng cao

Giá trị hấp thụ chứng chuẩn trong khoảng 0.150 - 1.300

Tính giá trị trung bình c a giá trị ngưỡng (CO): 

OD CO = (OD CO1 + OD CO2)/2

CO1: Giá trị chứng chuẩn 1

CO2: Giá trị chứng chuẩn 2

Tính tỉ số mẫu: Tỉ số mẫu = giá trị OD của mẫu x 10 /giá trị ngưỡng

Diễn giải kết quả

Nếu tỉ số < 9: mẫu thử thấp. 

Nếu 9 ≤ tỉ số ≤ 11: mẫu thử cần phải xét nghiệm lại. Nên thử sau 2-4 tuần. Nếu kết quả vẫn là 9 ≤ tỉ số ≤ 11 thì kết luận mẫu thử thấp.

Nếu tỉ số > 11: mẫu thử cao.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Sai sót

Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả hoặc phản ứng không xảy ra thông thường do: 

Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn. 

Chứng thấp và những mẫu bệnh phẩm thấp bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/ huyết tương có nồng độ kháng thể cao.

Xử trí 

Tuân thủ đúng các bước qui trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm sử dụng.

Kiểm tra và vệ sinh máy rửa thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm.

Không sử dụng thuốc thử đã quá hạn sử dụng.

Không nên dùng mẫu đã thấy rõ bị nhiễm khuẩn bằng mắt thường. 

Chỉ sử dụng các pipette và các dụng cụ sạch.

Nắp vẫn của lọ thuốc thử không được lẫn giữa các lọ thuốc thử để tránh nhiễm chéo.

Đóng lọ thuốc thử ngay lập tức sau khi sử dụng để tránh bay hơi và ô nhiễm vi sinh vật.